摘要 　 本文觀察了熱應(yīng)激預(yù)處理對(duì)腦缺血 / 再灌注昆明小鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠以雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉7 m i n后再通制作腦缺血 / 再灌注模型 ,在缺血 / 再灌注前予以熱應(yīng)激預(yù)處理。 根據(jù)不同的處理方法將動(dòng)物隨機(jī)分為四組 : ( 1 ) 正常對(duì)照組 , ( 2 )熱應(yīng)激預(yù)處理后缺血再灌注組 ( HS / I R ) , ( 3)缺血再灌注組 ( I R ) , ( 4 )單純熱應(yīng)激組 ( HS) ,后 3 組又分別分為 1 d 、4 d和 14 d三個(gè)亞組。水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶的行為改變 , **組織化學(xué)染色結(jié)合圖像分析技術(shù)檢測(cè)缺血 / 再灌注對(duì)海馬C A1 區(qū)神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白 2 2 (MAP-2 ) 的影響 , N issl染色計(jì)數(shù) C A1 區(qū)神經(jīng)元的數(shù)目。結(jié)果表明 : 與正常組、 HS 和 HS / I R 組比較 , I R組小鼠水迷宮檢測(cè)逃避潛伏期增加 ( P < 0 . 01 ) ,其搜索策略以邊緣式和限制式為主 ,而其它三組搜索策略則以趨向式和直線式為主。N issl染色顯示 I R組和 HS / I R組海馬錐體細(xì)胞減少 ,且 I R組細(xì)胞丟失比 HS / I R組更多 ( P < 0 . 05 ) ; MAP-2 **組化染色顯示 4 d時(shí)海馬 C A1區(qū)輻射層的樹突發(fā)生紊亂和斷裂 , MAP-2 有明顯減少 ( P < 0 . 05 ) , 14 d時(shí) I R組 MAP-2 陽(yáng)性表達(dá)主要聚集于胞漿中。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示 ,熱應(yīng)激預(yù)處理可以通過對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用改善動(dòng)物腦缺血 / 再灌注引起的學(xué)習(xí)記憶能力的下降。

關(guān)鍵詞 　　 熱應(yīng)激 　 Morris水迷宮 　 微管相關(guān)蛋白 2 2　 缺血 / 再灌注 　 海馬

　　 微管相關(guān)蛋白-2 ( microtubule associated protein2 , MA P-2 )是細(xì)胞骨架蛋白的一種 , 主要位于神經(jīng)元的樹突內(nèi) ,對(duì)穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的完整性具有重要作用 ,同時(shí)可介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管與其它細(xì)胞器間的相互作用 , 與神經(jīng)細(xì)胞的正常功能密切相關(guān)。MA P-2對(duì)腦缺血所導(dǎo)致的損傷很敏感 , 常作為缺血損傷的主要指標(biāo) 。海馬是缺血損傷敏感區(qū) , 而海馬與情緒 、 學(xué)習(xí)和記憶等腦的**功能密切相關(guān) ,因而缺血性腦損傷也將導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能 , 特別是空間辨別功能的障礙 。

近年發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)處理的組織器官對(duì)隨后嚴(yán)重?fù)p傷的耐受性明顯增強(qiáng) ,這種現(xiàn)象稱之為預(yù)適應(yīng) ,如缺血預(yù)適應(yīng) 、 熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)等 。熱應(yīng)激能對(duì)器官起保護(hù)性作用的現(xiàn)象早已被人們所發(fā)現(xiàn) , 其中**性熱水浴在中國(guó) 、 日本 、 芬蘭等國(guó)家廣泛被使用。有實(shí)驗(yàn)研究表明熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)能增強(qiáng)心臟組織對(duì)缺血的耐受性 ,但熱應(yīng)激預(yù)處理是否對(duì)因缺血所致的腦 ,特別是海馬神經(jīng)元損傷具有類似的保護(hù)作用 , 尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉制作昆明小鼠腦缺血 / 再灌注模型 ,觀察熱應(yīng)激預(yù)處理對(duì)小鼠學(xué)習(xí) 、 記憶和海馬神經(jīng)元的影響 ,探討熱應(yīng)激預(yù)處理對(duì)缺血腦組織的保護(hù)作用 。

材料和方法

1 . 　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康 6 月齡昆明小鼠 72 只 ( 雌雄不限 ) , 體重( 40 ± 5 ) g,由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供 。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)不同的處理方法分為 4 組 : ( 1 ) 正常對(duì)照組(No r m a l , n =18 ) ; ( 2 ) 熱應(yīng)激預(yù)處理后缺血再灌注組 ( HS / I R , n = 18 ) ; ( 3 ) 缺血再灌注組 ( I R , n =18 ) ; ( 4 ) 單純熱應(yīng)激組 ( H S, n = 18 ) 。H S組 、 I R 組和 H S / I R 組又分為 1 d 、 4 d 、 14 d 三個(gè)亞組 ( n = 6 / 亞組 ) 。

2 . 　 試劑

大鼠抗 MAP-2單克隆抗體購(gòu)自 Sternberger Monclonnals公司 ,羊抗鼠 I gG 、ABC試劑盒購(gòu)自美國(guó)V ector 公司 , DAB、 Triton X-100 購(gòu)自 Sigma 公司 ,30 % H2O2 為上海桃浦化工廠產(chǎn)品 。

3 . 　 Morris水迷宮測(cè)試

水迷宮購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司，材質(zhì)采用ABS工程塑料（汽車、飛機(jī)外殼材質(zhì)）模具制作，水池上空通過一攝像機(jī)和計(jì)算機(jī)相連接. 水池直徑約160cm ,深約50cm ,站臺(tái)高度 29c m ,池內(nèi)容自來水 ,水深 30 c m ,并用不透明的大小均勻的白色塑料泡沫覆蓋 ,液面距池壁上緣 20 c m , 水溫保持在 ( 22～26 ) ℃ 。 將圓池分為東南 、 東北 、 西南 、 西北 4 個(gè)象限 ,站臺(tái)位于其中任一象限內(nèi) , 距圓心 24 c m , 站臺(tái)頂端平面位于液面下 1 c m 。 圓池置于光線良好

的實(shí)驗(yàn)室內(nèi) ( 3 m × 5 m ) ,包括相對(duì)固定的迷宮外視覺線索 ( 工作臺(tái) 、 椅子 、 門 、 窗 、 書架及電燈等 ) 。每只動(dòng)物每天訓(xùn)練 4 次 , 歷時(shí) 3 d,全部行為學(xué)訓(xùn)練均在 10 ∶ 00 a m ～5 ∶ 00 p m 之間完成 。逃避潛伏期 : 檢測(cè)時(shí)將小鼠頭朝池壁輕輕放入水中 ,同時(shí)開始計(jì)時(shí) ,動(dòng)物自入水后至找到平臺(tái)后四肢爬上平臺(tái)所需時(shí)間作為逃避潛伏期 。搜索策略 : 觀察動(dòng)物入水后尋找站臺(tái)的游泳軌跡以確定其搜索策略 。記錄小鼠后 8次測(cè)試潛伏期 , 計(jì)算其均值 , 以平均潛伏期的 90 %區(qū)間作為篩選學(xué)習(xí)記憶功能正常小鼠的標(biāo)準(zhǔn) , 若未能達(dá)到此要求的動(dòng)物則棄去不用 。 在各組動(dòng)物處理后各時(shí)間點(diǎn)再作水迷宮檢測(cè) , 比較各組動(dòng)物處理前后潛伏期的差別以及游泳軌跡的改變 。

4 . 　 動(dòng)物模型制作

4 . 1 　 熱應(yīng)激動(dòng)物模型 　　H S 、 HS / I R 組的小鼠用2 %****鈉 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉 ,置于帶鼓風(fēng)裝置且具有適當(dāng)濕度的烤箱內(nèi) , 當(dāng)小鼠的體溫升至 ( 42 . 0 ± 0 . 5 ) ℃ ( 肛溫 ) 時(shí)維持 15 m i n, 然后到常溫環(huán)境 下 恢 復(fù) 1 h, 再 次 升 高 體 溫 至 ( 42 . 0 ± 0 .5 ) ℃,反復(fù) 3次 。

4 . 2 　 腦缺血 / 再灌注動(dòng)物模型 　　H S / I R、 I R 組的小鼠行缺血 / 再灌注處理 , 其中 HS / I R 組的動(dòng)物于熱應(yīng)激預(yù)處理后 24 h再實(shí)施以下操作 : 用 2 %****鈉 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉 , 仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上 ,頸前正中切口 , 鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈 , 微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈 7 m i n,小鼠在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈 60 s內(nèi)昏迷 ,翻正反射消失 ,雙側(cè)瞳孔放大 ,動(dòng)物瞳孔在缺血時(shí)變?yōu)樯n白并于整個(gè)缺血期維持不變 ,但能自主呼吸 。實(shí)驗(yàn)中保持小鼠體溫在 ( 37 . 0± 0 . 5 ) ℃ ( 肛溫 ) ,未昏迷的動(dòng)物說明未達(dá)到損傷的

要求 ,不予采用 。 腦缺血 7 m i n后解除動(dòng)脈夾 ,恢復(fù)腦血流 。 再灌注后瞳孔顏色立即轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色 , 分別于再灌注后 1 d 、 4 d 、 14 d處死動(dòng)物 。 各組動(dòng)物在各種處理前作 Mo rris水迷宮測(cè)試 , 以比較不同處理方法對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響 。

5 . 　 組織制備

用 2 %****鈉 ( 2 m g / kg) 腹腔注射麻醉動(dòng)物 ,開胸后于動(dòng)物左心室插管至升主動(dòng)脈 ,剪開右心房 ,先灌注生理鹽水 30 m l , 隨后灌注 4 ℃ 預(yù)冷的含4 %多聚甲醛的磷酸緩沖液 ( 0 . 1 mo l /L , pH 7 . 4 ) 60923 王春旭等 : 熱應(yīng)激對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

m l 。 恒溫切片機(jī)作連續(xù)冠狀切片 , 片厚 30 μ m , 取海馬和齒狀回平面 。

6 . 　 **組織化學(xué)

切片依次經(jīng)以下處理 : 0 . 01 mo l /L P B S洗 5 m i n× 3次 , 1 % H2 O2 室溫下處理 30 m i n; 再次用 P B S洗5 m i n × 3 次 , 0 . 3 % Trit on X2 100 + 5 % B S A 室溫封閉 1 h; 加大鼠抗 MA P2 2 單克隆抗體 ( 1 ∶ 5000 ) , 4 ℃孵育 24 h; 加生物素化羊抗大鼠 I gG ( 1 ∶ 200 ) , 室溫孵育 2 h; 加生物素 - 卵白素 - 辣根過氧化物酶復(fù)合物 (ABC, 1 ∶ 150 ) , 室溫下孵育 1 ～1 . 5 h 。各抗體轉(zhuǎn)換時(shí)均用 P B S洗 5 m i n × 3 次 ; 0 . 05 % DAB + 0 . 01 %H2 O2 避光呈色 ,鏡下控制反應(yīng)深度 。貼片 、 常規(guī)脫水 、 透明 、 封片 。O l y mp u s顯微鏡觀察并拍片 。陰性對(duì)照中以 P B S代替一抗 ,結(jié)果為陰性 。

7 . 　 N issl 染色

常規(guī) N issl 染色 ,用以計(jì)數(shù)海馬 C A1區(qū)神經(jīng)元 。

8 . 　 數(shù)據(jù)收集處理

光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)海馬 C A1 區(qū)神經(jīng)元 。用 H P I A S高清晰度彩色病理圖像測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定海馬 C A1 區(qū)神經(jīng)元胞漿 MA P2 2 陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物的平均灰度值 ( 自動(dòng)矯正背底灰度值 ) , 數(shù)值越大表明灰度越低 。 每例標(biāo)本檢測(cè) 3 張切片 , 每張切片檢測(cè) 3 個(gè)視野 。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 10 . 0 統(tǒng)計(jì)軟件分析 , 樣本均數(shù)的比較采用成組設(shè)計(jì)多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析 。 P < 0 . 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

結(jié) 　　 果

1 . 　 行為學(xué)檢測(cè)

正常對(duì)照組小鼠的逃避潛伏期時(shí)間比較穩(wěn)定 ,在 20 s左右可找到平臺(tái) ; H S組和 H S / I R 組小鼠的逃避潛伏期時(shí)間與正常組比較略有增加 , 且波動(dòng)較大 ,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P > 0 . 05 ) 。處理后 14 d, 記錄各組動(dòng)物搜索策略顯示上述 3組動(dòng)物均以直線式和趨向式搜索策略為主 , 邊緣式的搜索策略少 。而I R 組小鼠在再灌注后 4 d 和 14 d 的逃避潛伏期顯

著增加 ,與正常對(duì)照組 、 HS組 、 H S / I R 組相比逃避潛伏期明顯延長(zhǎng) ( P < 0 . 01 ) , I R 組搜索策略也轉(zhuǎn)變?yōu)檫吘壥胶拖拗剖綖橹?nbsp; 。

2 . 　 N issl 染色結(jié)果

在 N issl染色的切片上 ,正常對(duì)照組和 H S組小鼠海馬 C A1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)沒有明顯的差別 ,均可見數(shù)層錐體細(xì)胞排列整齊規(guī)則 ,胞漿染色清晰 ,胞核淡染 ; 而 I R 組和 HS / I R 組海馬 C A1 區(qū)錐體神經(jīng)元胞體腫脹 ,排列散亂 , 細(xì)胞間距加大 , 錐體神經(jīng)元數(shù)目減少 ( F i g . 1 A 2 D ) 。小鼠海馬 C A1 區(qū)存活錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)表明 , 4 d后 HS / I R 組和 I R 組神經(jīng)元數(shù)較正常組和 H S組明顯減少 ( P < 0 . 01 ) ; 4 d 和 14 d I R組神經(jīng)元數(shù)與 H S / I R 組比較錐體細(xì)胞進(jìn)一步減少( P < 0 . 05 ) 。

3 . 　 MA P-2**組織化學(xué)染色結(jié)果

正常組與 HS組的 MA P-2**陽(yáng)性產(chǎn)物在形態(tài)和分布上相似 , MA P-2 陽(yáng)性的樹突平滑 、 完整 , 而核周 MA P-2陽(yáng)性產(chǎn)物較弱 ; 4 d I R 組海馬 C A1 區(qū)輻射層 MA P-2陽(yáng)性產(chǎn)物減弱 ,突起斷裂 ,螺旋化改變 ;而 HS / I R 組輻射層 MA P-2 表達(dá)與正常組相似 ; 14 d的 I R 組觀察到海馬 C A1 區(qū)錐體神經(jīng)元樹突 MA P-2幾乎消失 ,而在核周有 MA P-2聚集 ( F i g . 1 E～ I ) 。 采用平均灰度值表示 MA P2 2 的陽(yáng)性**產(chǎn)物 , 反應(yīng)產(chǎn)物少的平均灰度值高 。 與正常組 、 HS組和 H S /I R 組比較 , 4 d 的 I R 組海馬 C A1 區(qū)輻射層 MA P-2陽(yáng)性產(chǎn)物減弱 ( P < 0 . 05 ) 。

討 　　 論

1 . 　 熱應(yīng)激預(yù)處理對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的影響

學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)檢測(cè)方法主要有 Y迷宮 、 水迷宮 、 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 、 避暗實(shí)驗(yàn)等 , 而 Mo rris水迷宮因其操作簡(jiǎn)便 ,可記錄指標(biāo)較多而成為應(yīng)用*為廣泛的一種 。 本實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠手術(shù)前后 Mo rris水迷宮測(cè)試來評(píng)估處理因素對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響 。 結(jié)果表明 ,與 HS組 、 H S / I R 組和正常組比較 , I R 組小鼠逃避潛伏期明顯下降 ,而且 I R 組小鼠的搜索策略也相應(yīng)地發(fā)生了變化 ,由正常組的直線式為主轉(zhuǎn)變?yōu)檫吘壥胶碗S機(jī)式為主 , 表明小鼠的空間辨別和記憶能力下降 。HS組和 HS / I R 組動(dòng)物的直線式搜索策略相對(duì)減少 ,而趨向式的搜索策略比對(duì)照組相對(duì)增加 ,可能是因?yàn)橹本€式搜索策略需要**的記住平臺(tái)所在的位置 。 任何對(duì)方向的不確定和對(duì)平臺(tái)位置的猶豫都可能導(dǎo)致搜索方式從直線式變?yōu)橼呄蚴?nbsp;。 但是采用直線式和趨向式搜索策略的小鼠都具有較好的記憶能力。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示 HS組和 HS / I R 組小鼠的記憶能力好于 I R 組小鼠 ,即熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)對(duì)因腦缺血所致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙具有一定的保護(hù)作用 。熱應(yīng)激對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

2 . 　 熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)與海馬神經(jīng)元骨架蛋白

腦缺血時(shí) , 海馬 C A1 區(qū)為易損區(qū) , C A3 區(qū)為相對(duì)耐受區(qū)。神經(jīng)元骨架蛋白是缺血損傷敏感的指標(biāo) ,其完整性對(duì)維持神經(jīng)元的形態(tài)和功能有重要作用 。 微管相關(guān)蛋白-2 (MA P-2 ) 是神經(jīng)元內(nèi)重要的細(xì)胞骨架蛋白成分 , 在神經(jīng)元發(fā)育 、 分化 、 可塑性方面起著主導(dǎo)作用。MA P-2 有許多重要功能 , 包括快速軸漿運(yùn)輸與神經(jīng)遞質(zhì)釋放 , 神經(jīng)元發(fā)育過程中的構(gòu)型與穩(wěn)定等 。MA P-2 的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的損壞可以導(dǎo)致神經(jīng)元的功能障礙 , 甚至神經(jīng)元死亡。電鏡觀察表明 ,即使短暫缺血也會(huì)引起細(xì)胞骨架的紊亂及蛋白成分不可逆變性 , MA P-2 對(duì)腦缺血易敏感 ,常作為缺血誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的早期標(biāo)記物。熱應(yīng)激對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)表明 ,正常對(duì)照組海馬 C A1區(qū) MA P-2 **陽(yáng)性的樹突平滑且完整 , 直徑均勻 ; 而腦缺血 / 再灌注后 4 d, MA P-2 **陽(yáng)性的樹突出現(xiàn)斷裂 、 螺旋化改變 , 海馬 C A1 區(qū)輻射層 MA P-2 表達(dá)明顯減弱( P < 0 . 05 ) 。 這種現(xiàn)象在本室以前的研究中也得到了證實(shí)。 經(jīng)過熱應(yīng)激預(yù)處理腦缺血 / 再灌注后 4d,海馬 C A1 區(qū)神經(jīng)元的樹突結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯斷裂 、 螺旋化改變 ; H S / I R 組輻射層 MA P2 2 與正常組比較無明顯差別 ,同時(shí)神經(jīng)元的數(shù)量也無明顯丟失 ,提示熱應(yīng)激預(yù)適應(yīng)可以使神經(jīng)元骨架蛋白成分免受缺血損傷 。缺血性腦損傷后 , 除了存在一種主動(dòng)性的程序性細(xì)胞死亡 ( 凋亡 )過程 , 在耐受細(xì)胞內(nèi)還存在一種主動(dòng)性神經(jīng)元存活過程。14 d的 I R 組觀察到海馬 C A1 區(qū)錐體神經(jīng)元樹突 MA P-2 幾乎消失 ,而在核周有 MA P-2聚集 。本室以前的研究證明隨著腦缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng) , MA P-2 在神經(jīng)元內(nèi)分布的改變 : 樹突內(nèi)的 MA P-2 表達(dá)減少 , 轉(zhuǎn)而出現(xiàn)胞漿內(nèi)的表達(dá)增加 ,推測(cè)細(xì)胞開始合成新的微管蛋白 ,參與細(xì)胞的主動(dòng)性修復(fù) ,維持細(xì)胞的存活?？傊?nbsp;,熱應(yīng)激可改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 ,這可能與熱應(yīng)激減少 C A1 區(qū)神經(jīng)元丟失 ,保護(hù) MA P-2免受缺血損傷有關(guān) ,其機(jī)制有待深入研究 。