脾虛對大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的研究
材料與方法
1． 實(shí)驗(yàn)動物：
選取清潔級12周齡Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重180±20g，由中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證（檢證字）2001A038號，（中山醫(yī)動字）2002053號。動物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施合格證書醫(yī)動字第23-016號，動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼料由福建中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。
2． 實(shí)驗(yàn)藥品：
實(shí)驗(yàn)所需中藥材向福建省藥材公司購買道地藥材，實(shí)驗(yàn)所需試劑雙縮脲蛋白定量測試盒、NO測試盒、NOS測試盒及一些配用試劑由福建中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室向南京建成生物研究所代為購買或提供，試劑盒批號20021010。
3． **配制：
（1）造模** 小承氣湯由厚樸、枳實(shí)、大黃組成。質(zhì)量比按3：3：2配備，先經(jīng)蒸餾水浸泡2h，按常法煎煮2次，每次煮沸后煎煮20min過濾，合并濾液，70-80℃水浴濃縮為2g/ml藥液，冰箱儲存?zhèn)溆谩?/span>
（2）**** 四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成。質(zhì)量比按2：2：2：1配備，先經(jīng)蒸餾水浸泡2h，按常法煎煮2次，每次40min過濾，合并濾液，70-80℃水浴濃縮為2g/ml藥液，冰箱儲存?zhèn)溆谩?/span>
以上實(shí)驗(yàn)用湯劑由福建中醫(yī)學(xué)院屏山制藥廠加工制成所需制劑。
4． 儀器設(shè)備：
RF—540熒光分光光度計(jì) 上海
721分光光度計(jì) 上海
BACMON高速冷凍離心機(jī) 中國
恒溫水浴箱 中國
SAYAN超低溫冰箱 日本
上海欣軟信息科技有限公司提供上等的morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)。
5． 造模方法：
參照傅湘琦等依據(jù)中醫(yī)耗氣破氣和飲食失節(jié)的理論塑造大鼠脾虛模型的方法[43]，稍加以改進(jìn)。造模組隔日給藥，上、下午各一次，每次2毫升，給藥后**日禁食，自由飲水，造模時(shí)間為6周。
6． 分組與施加因素：
（1）分組 動物適養(yǎng)三天后，大鼠隨機(jī)分成2大組，正常組A組、模型組B組，正常組20只，模型組60只，正常組又分為A1、A2 2小組，分別用來與生化測定各組和行為測定各組進(jìn)行比較；模型組分為脾虛組B1、C1、脾虛**組B2、C2和脾虛自由恢復(fù)組B3、C3 6小組，每小組各10只，雌雄各半。其中A1、B1、B2、B3 4組用來測定生化指標(biāo)，A2、C1、C2、C3 4組用來測定行為學(xué)指標(biāo)。
（2）施加因素 首先對模型組B組造模，造模時(shí)A組予等量生理鹽水。造模成功后， A1、B1進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)測定， A2、C1進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)；B2、C2組灌服四君子湯，每天上、下午各1次，每次2ml，連續(xù)10天， B3 、C3予等量生理鹽水，大鼠服藥劑量按《中藥藥理研究方法學(xué)》[44]所提供的“實(shí)驗(yàn)動物與人按體表面積等效劑量換算比率表”倍數(shù)折算。10天后B2、B3進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)測定，C2、C3進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。
7． 標(biāo)本的采集與制備：
大鼠給藥結(jié)束后，斷頭處死，快速取腦，稱濕重，于冰盤上迅速剝離表面漿膜及血管，取左側(cè)大腦皮層固定部位1.0×1.0cm組織，稱重,以冷生理鹽水作勻漿介質(zhì)，研磨制成10%的腦勻漿液，離心取清，冰箱儲存待測。
8． 生化指標(biāo)的觀測及方法：
（1）標(biāo)本蛋白含量測定 采用雙縮脲法測定標(biāo)本蛋白定量，凡分子中含有兩個(gè)氨基甲酰基（-CONH2）的化合物能與堿性酮溶液作用，形成紫色復(fù)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)，蛋白分子中有許多肽鍵（-CONH-）都能起此反應(yīng)，各種蛋白顯色程度基本相同。具體操作參照試劑盒說明書。
（2）腦組織NO含量測定 應(yīng)用改良的Griess法[45]，通過測定NO代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2-)和硝酸鹽(NO3-)的濃度作為衡量NO含量的指標(biāo)。具體操作參照NO試劑盒說明書。
（3）腦組織NOS活性測定 在有氧和輔助因子的情況下，NOS催化L-精氨酸生成L-狐氨酸和NO。由于氧合血紅蛋白可與NO迅速而不可逆地生成高鐵血紅蛋白(mG)。因而，通過分光光度法(雙波長法)檢測形成的mG，可反映由NOS催化生成的NO量，從而間接測定NOS的活性。具體操作參照NOS試劑盒說明書，分別測出總的NOS和cNOS、iNOS活性。
以上各項(xiàng)生化指標(biāo)的測試均由專業(yè)人員進(jìn)行測試，測定結(jié)果均以換算后的測定值與其相應(yīng)蛋白含量的比值表示。
9． Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 脾虛對大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的實(shí)驗(yàn)研究
（1） 定位航行試驗(yàn)(place navigation) 試驗(yàn)開始先將大鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳2分鐘，使其熟悉迷宮環(huán)境。試驗(yàn)共歷時(shí)5天，每天定于固定時(shí)間段(blocks)，每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練開始時(shí)，將平臺置于NW象限，從池壁四個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時(shí)間(逃避潛伏期，escape latency)和游泳路徑，4次訓(xùn)練即將大鼠分別從四個(gè)不同的起始點(diǎn)（不同象限）放入水中。大鼠找到平臺后或120秒內(nèi)找不到平臺(潛伏期記為120秒)，則由實(shí)驗(yàn)者將其拿上平臺，在平臺上休息15秒，再進(jìn)行下一次試驗(yàn)。每日以大鼠四次訓(xùn)練潛伏期的平均值做為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。
（2） 空間探索試驗(yàn)(spatial probe) 第6天撤除原平臺，將大鼠任選1個(gè)入水點(diǎn)放入水中，所有大鼠必須為同一入水點(diǎn)，記錄大鼠在2min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)。
10．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
結(jié)果均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所用數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x1±s）表示，各組間比較用t檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1． 各組造模及給藥前后一般情況觀察
正常對照組及其余各組造模前動物精神好，動作靈活，毛發(fā)白而有光澤，皮膚粘膜紅潤，飲食量、飲水量多，體重呈直線上升；造模后模型各組動物精神萎糜，乏力、倦怠、閉目、喜扎堆、納食減少，體重逐漸下降或持平，皮毛疏松、粗糙無光澤，且顏色發(fā)黃、易脫落、足蹼、鼻尖、耳緣粘膜出現(xiàn)蒼白，**周圍充血、濕潤，造模一周后出現(xiàn)稀便，三周后個(gè)別動物因極度衰弱死亡（C3組死亡1只）。**組動物隨著中藥**，飲食逐漸恢復(fù)，動物功能低下的表現(xiàn)逐漸改善，皮毛變得舒展，粘膜逐漸紅潤、體重也逐漸增加，至給藥結(jié)束時(shí)基本恢復(fù)正常，與正常對照組比較無明顯異常；自然恢復(fù)組動物停止造模條件后，—般表現(xiàn)均不同程度改善，但較中藥**組恢復(fù)明顯緩慢。脾虛對大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的實(shí)驗(yàn)研究
2.正常組與脾虛組大鼠腦組織中NO含量和NOS活性比較
表1：正常組與脾虛組大鼠腦組織中NO含量和NOS活性比較（x1±s）
組別 n NO NOS（U/mgprot）
?。?/span>μmol/gprot） 總NOS cNOS iNOS
正常組A1 10 1.91±0.53 146.06±41.90 115.96±41.56 30.10±3.55
脾虛組B1 10 0.99±0.431） 62.95±21.771） 45.72±23.031） 17.23±5.631）
注：與正常組比較，1）P<0.01
表2：大鼠腦組織中NO含量和NOS活性比較（x1±s）
組別 n NO NOS（U/mgprot）
?。?/span>μmol/gprot） 總NOS cNOS iNOS
脾虛組**組B2 10 1.80±0.30 121.43±27.79 94.33±28.47 27.10±5.93
脾虛組自由恢復(fù)組B3 10 1.25±0.292） 81.05±21.182） 62.70±17.312） 18.35±4.681）
注：與**組比較，1）P<0.05、1）P<0.01
從表中可看出：正常組與脾虛組比較，脾虛組NO含量、NOS活性明顯較正常組低，差異顯著 (P<0.01) ，見表1；脾虛**組與脾虛自由恢復(fù)組比較，脾虛自由恢復(fù)組NO含量、NOS活性明顯較正常組低，差異顯著 (P<0.01) ，見表2。
3.各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)中正常組與脾虛組比較，正常組大鼠在MWM中定位平臺的學(xué)習(xí)獲得過程較快，脾虛組尋找平臺的潛伏期明顯延長，學(xué)習(xí)獲得比較慢，有的大鼠甚至到訓(xùn)練結(jié)束還未學(xué)會尋找平臺，二組之間差異顯著。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3；脾虛**組與脾虛自由恢復(fù)組比較，脾虛**組在MWM中定位平臺的學(xué)習(xí)獲得過程較快，脾虛自由恢復(fù)組學(xué)習(xí)獲得較慢，二組之間差異顯著，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。脾虛對大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的實(shí)驗(yàn)研究
表3 正常組與脾虛組大鼠潛伏期變化及跨臺次數(shù)比較（x1±s）
組別 n 潛伏期（s） 跨臺次數(shù)（次）
**天 **天 第三天 第四天 第五天
正常組A2 10 48.99±19.24 35.42±9.501) 21.07±12.321) 20.50±12.371) 14.24±4.101) 7.50±2.551)
脾虛組C1 10 53.24±19.23 49.48±12.87 45.28±10.51 38.92±8.07 35.93±7.57 4.30±1.25
注：與正常組比較，1）P<0.01
表4 脾虛**組與脾虛自由恢復(fù)組大鼠潛伏期變化及跨臺次數(shù)比較（x1±s）
組別 n 潛伏期（s） 跨臺次數(shù)（次）
**天 **天 第三天 第四天 第五天
脾虛**組C2 10 59.88±20.23 39.36±14.63 27.71±8.86 18.61±12.35 15.89±9.63 7.20±1.99
脾虛自由恢復(fù)組C3 9 47.20±20.69 40.88±14.08 38.22±10.201) 35.98±9.082) 31.48±7.292) 5.10±1.791)
注：與脾虛**組比較， 1）P<0.05、2）P<0.01
在定位航行試驗(yàn)中，4組大鼠在歷時(shí)5d的水迷宮訓(xùn)練中，潛伏期結(jié)果的動態(tài)變化見圖1。各組大鼠在訓(xùn)練第1天中，絕大多數(shù)不能在規(guī)定的120s內(nèi)找到平臺，不少大鼠穿過了平臺但不知停留或站立。從第2天開始陸續(xù)有大鼠能自由尋找到平臺逃避，隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，逃避潛伏期不斷縮短，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析除正常組與脾虛組有差異外，其余各組大鼠的逃避潛伏期差異無顯著性(P>0.05)。從第3天起各組大鼠潛伏期拉開距離，4組大鼠找到平臺所需時(shí)間分別為45s、38s、28s和21s，脾虛組與正常對照組、脾虛自由恢復(fù)組與脾虛**組差異顯著(P<0.01)。在后兩天的訓(xùn)練中各組大鼠成績逐漸趨于穩(wěn)定。脾虛組有部分大鼠直到訓(xùn)練結(jié)束還未學(xué)會尋找平臺。
脾虛對大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的實(shí)驗(yàn)研究
